Materi lengkap tentang fiksasi nitrogen

 

      1.         Fiksasi Nitrogen

Nitrogen adalah unsur yang paling berlimpah di atmosfer (78% gas di atmosfer adalah nitrogen). Meskipun demikian, penggunaan nitrogen pada bidang biologis sangatlah terbatas. Nitrogen merupakan unsur yang tidak reaktif (sulit bereaksi dengan unsur lain) sehingga dalam penggunaan nitrogen pada makhluk hidup diperlukan berbagai proses, yaitu diantaranya: fiksasi nitrogen, mineralisasi, nitrifikasi, denitrifikasi.

Siklus nitrogen sendiri adalah suatu proses konversi senyawa yang mengandung unsur nitrogen menjadi berbagai macam bentuk kimiawi yang lain. Transformasi ini dapat terjadi secara biologis maupun non-biologis. Siklus nitrogen secara khusus sangat dibutuhkan dalam ekologi karena ketersediaan nitrogen dapat mempengaruhi tingkat proses ekosistem kunci, termasuk produksi primer dan dekomposisi. Aktivitas manusia seperti pembakaran bahan bakar fosil, penggunaan pupuk nitrogen buatan, dan pelepasan nitrogen dalam air limbah telah secara dramatis mengubah siklus nitrogen global.

Di alam, Nitrogen terdapat dalam bentuk senyawa organik seperti urea, protein, dan asam nukleat atau sebagai senyawa anorganik seperti ammonia, nitrit, dan nitrat.

Tahap pertama

Daur nitrogen adalah transfer nitrogen dari atmosfir ke dalam tanah. Selain air hujan yang membawa sejumlah nitrogen, penambahan nitrogen ke dalam tanah terjadi melalui proses fiksasi nitrogen. Fiksasi nitrogen secara biologis dapat dilakukan oleh bakteri Rhizobium yang bersimbiosis dengan polong-polongan, bakteri Azotobacter dan Clostridium. Selain itu ganggang hijau biru dalam air juga memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen.

Tahap kedua

Nitrat yang di hasilkan oleh fiksasi biologis digunakan oleh produsen (tumbuhan) diubah menjadi molekul protein.

Selanjutnya jika tumbuhan atau hewan mati, mahluk pengurai merombaknya menjadi gas amoniak (NH3) dan garam ammonium yang larut dalam air (NH4+). Proses ini disebut dengan amonifikasi. Bakteri Nitrosomonas mengubah amoniak dan senyawa ammonium menjadi nitrat oleh Nitrobacter. Apabila oksigen dalam tanah terbatas, nitrat dengan cepat ditransformasikan menjadi gas nitrogen atau oksida nitrogen.

Fungsi Dalam Ekologi

Nitrogen sangatlah penting untuk berbagai proses kehidupan di Bumi. Nitrogen adalah komponen utama dalam semua asam amino, yang nantinya dimasukkan ke dalam protein, tahu kan kalau protein adalah zat yang sangat kita butuhkan dalam pertumbuhan. Nitrogen juga hadir di basis pembentuk asam nukleat, seperti DNA dan RNA yang nantinya membawa hereditas. Pada tumbuhan, banyak dari nitrogen digunakan dalam molekul klorofil, yang penting untuk fotosintesis dan pertumbuhan lebih lanjut. Meskipun atmosfer bumi merupakan sumber berlimpah nitrogen, sebagian besar relatif tidak dapat digunakan oleh tanaman. Pengolahan kimia atau fiksasi alami (melalui proses konversi seperti yang dilakukan bakteri rhizobium), diperlukan untuk mengkonversi gas nitrogen menjadi bentuk yang dapat digunakan oleh organisme hidup, oleh karena itu nitrogen menjadi komponen penting dari produksi pangan. Kelimpahan atau kelangkaan dari bentuk "tetap" nitrogen, (juga dikenal sebagai nitrogen reaktif), menentukan berapa banyak makanan yang dapat tumbuh pada sebidang tanah.

Transformasi nitrogen ini dapat terjadi secara biologis maupun non-biologis. Walaupun terdapat sangat banyak molekul nitrogen di dalam atmosfir, nitrogen dalam bentuk gas tidaklah reaktif. Hanya beberapa organisme yang mampu untuk mengkonversinya menjadi senyawa organik dengan proses yang disebut fiksasi nitrogen.

Fiksasi nitrogen adalah proses alam, biologis atau abiotik yang mengubah nitrogen di udara menjadi ammonia (NH₃). Mikroorganisme yang mem-fiksasi nitrogen disebut diazotrof. Mikroorganisme ini memiliki enzim nitrogenaze yang dapat menggabungkan hidrogen dan nitrogen. Reaksi untuk fiksasi nitrogen biologis ini dapat ditulis sebagai berikut :

N2 + 8 H+ + 8 e− → 2 NH3 + H2

Mikro organisme yang melakukan fiksasi nitrogen antara lain : Cyanobacteria, Azotobacteraceae, Rhizobia, Clostridium, dan Frankia. Selain itu ganggang hijau biru juga dapat memfiksasi nitrogen. Beberapa tanaman yang lebih tinggi, dan beberapa hewan (rayap), telah membentuk asosiasi (simbiosis) dengan diazotrof. Selain dilakukan oleh mikroorganisme, fiksasi nitrogen juga terjadi pada proses non-biologis, contohnya sambaran petir. Lebih jauh, ada empat cara yang dapat mengkonversi unsur nitrogen di atmosfer menjadi bentuk yang lebih reaktif :

a.         Fiksasi biologis: beberapa bakteri simbiotik (paling sering dikaitkan dengan tanaman polongan) dan beberapa bakteri yang hidup bebas dapat memperbaiki nitrogen sebagai nitrogen organik. Sebuah contoh dari bakteri pengikat nitrogen adalah bakteri Rhizobium mutualistik, yang hidup dalam nodul akar kacang-kacangan. Spesies ini diazotrophs. Sebuah contoh dari hidup bebas bakteri Azotobacter.

b.        Industri fiksasi nitrogen : Di bawah tekanan besar, pada suhu 600 C, dan dengan penggunaan katalis besi, nitrogen atmosfer dan hidrogen (biasanya berasal dari gas alam atau minyak bumi) dapat dikombinasikan untuk membentuk amonia (NH3). Dalam proses Haber-Bosch, N2 adalah diubah bersamaan dengan gas hidrogen (H2) menjadi amonia (NH3), yang digunakan untuk membuat pupuk dan bahan peledak.

c.         Pembakaran bahan bakar fosil : mesin mobil dan pembangkit listrik termal, yang melepaskan berbagai nitrogen oksida (NOx).

Fiksasi nitrogen yang lain terjadi karena proses geofisika, seperti terjadinya kilat. Kilat memiliki peran yang sangat penting dalam kehidupan, tanpanya tidak akan ada bentuk kehidupan di bumi. Walaupun demikian, sedikit sekali makhluk hidup yang dapat menyerap senyawa nitrogen yang terbentuk dari alam tersebut. Hampir seluruh makhluk hidup mendapatkan senyawa nitrogen dari makhluk hidup yang lain. Oleh sebab itu, reaksi fiksasi nitrogen sering disebut proses topping-up atau fungsi penambahan pada tersedianya cadangan senyawa nitrogen.

Vertebrata secara tidak langsung telah mengonsumsi nitrogen melalui asupan nutrisi dalam bentuk protein maupun asam nukleat. Di dalam tubuh, makromolekul ini dicerna menjadi bentuk yang lebih kecil yaitu asam amino dan komponen dari nukleotida, dan dipergunakan untuk sintesis protein dan asam nukleat yang baru, atau senyawa lainnya.

          Jajaran Organisme Pengikat Nitrogen

Ada beberapa organisme yang dapat mengikat nitrogen. Pertama, semua bakteri : prokaryota sederhana yang tak berinti. Meskipun telah banyak dilakukan pengamatan, namun belum ada satu pun ditemukan organisme eukaryotik berinti yang melakukan fiksasi nitrogen.

Kedua anggota kelompok pengikat nitrogen itu secara taksonomi banyak macamnya dan terjadi secara sporadic.

Ketiga, banyak bekteri yang tidak mampu mengikat nitrogen sendiri. Tapi hidup bersimbiosa dengan tumbuhan tinggi. Ini terjadi juga dengan masalah energi. Jika bakteri itu hidup bersama dengan tumbuhan hijau yang mengikat karbon, hasilnya adalah pertukaran bahan nutrisi yang saling menguntungkan. Tumbuhannya mendapat nitrogen yang telah difiksasi, sedangkan bakterinya menerima karbon yang telah terfiksasi pula, yang dipakai untuk menghasilkan energi.

         Biokimia Nitrogenase

Kemampuan khusus bakteri pemfiksasi nitrogen untuk mereduksi N₂ menjadi ammonia tergnatung pada system enzimyang disebut “kompleks nitrogenase”. Kompleks ini ternyata sama benar sifatnya dalam mengikat nitrogen sampai kini.

Pengetahuan yang di dapat kini menunjukkan, bahwa kompleks nitrogenase terdiri dari enam protein  dan mengandung dua aktivitas enzim berbeda. Satu disebut nitrogenase saja, dan yang lain disebut nitrogenase reduktase. Komponen nitrogenase dari kompleks itu mengandung empat subunit yang dibina atas dua macam protein. Masing-masing protein rangkap dua. Molekulnya juga mengandung kofaktor. Kofaktor itu adalah besi molybdenum, berarti mengandung besi molybdenum. Struktur kofaktor belum diketahui meski telah bertahun-tahun diselidiki.

Reduksi N₂ banyak mengandung energi. Ada 20 sampai 30 molekul adenosine trifosfat (ATP), alat tukar energy dalam sel, diperlukan untuk menunjang reduksi satu molekul nitrogen menjadi ammonia. Lagipula reaksi nitrogenase banyak menghasilkan ampas, karena ia juga menghasilkan ion nitrogen menjadi molekul hydrogen, H₁ yang berupa gas.

Nitrogenase reduktase berberat molekul 60.000 dan terdiri dari dua molekul subunit protein yang identik. Cirinya berwarna coklat, karena mengandung untaian besi dan belerang.

         Masalah Oksigen

Satu lagi hal yang penting ttentang nitrogenase ialah bahwa oksigen meracun baginya. Jika terpapar udara enzim itu kehilangan separuh aktivitasnya dalam tempo 30 detik, dan tidak dapat pulih kembali.

Salah satu strategi yang diambil oleh bakteri genus Clostridium ialah hidup dalam lingkungan yang bebas oksigen. Bagi bakteri ini risiko kerusakan oleh oksigen tak pernah muncul. Pengikat nitrogen lain seperti bakteri Klebsiella pneumonia, dapat hidup baik dalam lingkungan beroksigen maupun tak beroksigen, tapi hanya dapat mengfiksasi nitrogen jika tumbuh dalam lingkungan anaerobis.

       A.      Sifat Genetik Fiksasi Nitrogen

 Makin banyak bakteri pemfikasi nitrogen yang kini sedang diamati dengan teknik genetika dan biologi molekuler. Tetapi organism yang dipakai oleh eksperimen yang asli untuk pengamatan demikian dan yang telah dianalisa paling rinci ialah Klebsiella pneumonia. Bakteri ini tidak bersimbiosa dengan organism lain dan dapat tumbuh dengan baik dalam kultur. Lagi pula, bakteri ini mendapat perlakuan genetis yang sama dengan yang dilakukan terhadap Escherichia colii, jenis bakteri yang ada hubungan kerabat dengannya.

Apa yang dipelajari tentang gen nif pada K. pneumonia bukan hanya member rancangan kerja intelektual untuk mempelajari genetika biokimia fiksasi nitrogen. Tetapi juga dapat dipakai untuk menganalisa proses fiksasi nitrogen pada bakteri lain yang sifat genetisnya tidak begitu mudah dapat dianalisa. Sebagian kecil kromosom K. pneumonia, jika dipindahkan ke E. Coli, membuat sel resipien itu dapat mengikat nitrogen. Ini menunjukkan bahwa gen nif  dari K. pneumonia  membentuk suatu rangkaian pada kromosom. Meskipun reduksi N₂ sehingga menjadi amonia dapat terjadi sebagai reaksi yang berjalan langsung, namun untuk itu K. pneumonia harus mengerahkan tak kurang dari 17 gen. semuanya diberi imbuhan huruf abjad bagi nif : A, B, E, H, K dan seterusnya. Gen-gen nif  yang menyandi reaksi itu menempati sekitar 22 kilobasa pada DNA kromosom.

Gen nif  menyandi protein nitrogenase reduktase, sedangkan gen nifD dan nifK menyandi 2 komponen protein nitrogenase. Lima gen lain (nifH, X, V, N, dan E) terlibat dalam mensintesa kofaktor besi molybdenum yang jalan reaksinya belum dapat diungkapkan, dan dua gen (nifF dan J) menyandi polipeptida yang diperlukan untuk transfer electron kepada nitrogenase reduktase. Tiga gen (nifM, S, V) diperlukan untuk mematangkan kompleks nitrogenase yang fungsional, dan dua (nifA, dan nifL) ternyata mengatur ekspresi semua gen nif lain. Akhirnya fungsi nifX dan nifY belum diketahui peranannya.

Beberapa gen nif pada organism pemfiksasi nitrogen lain terbukti sama benar strukturnya dengan yang terdapat pada K. pneumonia. Namun, pada organism pemfiksasi nitrogen lain, gen-gen itu biasanya tersebar sekitar genom, bukan membentuk suatu rangkaian rapat seperti pada K. pneumonia.

       B.       Mengatur Ekspresi Gen nif

Jika bakteri pemfiksasi nitrogen menemukan sumber nitrogen yang sudah terfiksasi, seperti berupa amonia, glutamate, atau asparagin, maka transkripsi gen-gen nif  pun berhenti. Dengan demikian organism itu tidak membuang-buang energy, karena ini masih diperlukan untuk mensintesa protein. Juga tidak mebuang-buang ATP , karena ini diperlukan pula untuk mendorong reaksi reduksi. Gen-gen itu juga tidak berekspresi jika selnya terpapar ke udara. Ini juga membuat suasana kehidupan jadi baik.

Pengaturan gen nif sangat kompleks. Pemgaturan itu meliputi control local oleh gen dalam kompleks nif, dan komtrol yang lebih menyeluruh oleh gen pengatur yang terletak dibagian lain genom. Agar gen nif mulai berekspresi, seperti pada semua gen lain, diperlukan enzim RNA polymerase untuk mentranskripsi DNA menjadi RNA messenger.

Promotor adalah daerah pengontrol pada suatu gen. RNA polymerase akan berikatan dengan promoter itu sewaktu transkripsi dimulai. Urutan nukleotida gen nif  berbeda sekali dengan promoter suatu gen yang sudah banyak diamati pada E. coli. Ini member pandangan bahwa DNA polymerase yang mengenal promoter gen nif  beda dari enzim yang berikatan dengan promoter gen lain. Pandangan ini belum lama berselang telah dikukuhkan.

Mutasi pada gen yang disebut ntrA (ntr adalah untuk mengatur nitrogen, nitrogen regulation), bukan anggota kompleks nif, menyebabkan fiksasi nitrogen hilang. Boris Magasanik dari Massachusetts, dan S. Kustu dari University of California di Davis, telah menetapkan bahwa gen ntrA mengenal promoter gen nif. Tanpa protein ini gen nif  termasuk pengatur nifA dan L, tak dapat bertranskripsi, sehingga fiksasi nitrogen tak terjadi. Factor sigma lain menolong RNA polymerase agar dapat mengenal promoter gen lain.

       C.      Fiksasi Nitrogen Secara Simbiosa

Bakteri pengikat nitrogen yang terpenting, baik untuk pertanian maupun ekologi, adalah yang berinteraksi dengan tumbuhan dengan cara simbiosa. Simbiosa ada yang berbentuk sedehana dan yang kompleks. Bentuk interaksi sederhana terdapat pada bakteri Azosfirillumyang hidup sekitar permukaan rumputan. Pada interaksi yang berbentuk kompleks, seperti interaksi bakteri genus Rhizobium dan kacang-kacangan. Kacang-kacangan dapat subur pada tanah yang miskin nitrogen, berkat kehadiran simbion yang memfiksasi nitrogen. Dengan demikian famili tumbuhan ini sangat besar peranannya dalam pertanian.

Memahami interaksi simbiotis memerlukan analisa terhadap, bukan hanya gen nif , tapi juga tentang gen-gen khusus pada tumbuhan dan bakteri yang membuat mereka hidup berinteraksi demikian kompleks. Kebanyakan strain tak dapat di dorong untuk memfiksasi nitrogen jika ditanam sendirian dalam kultur. Namun bakteri ini memiliki kemampuan khusus untuk mengenal dan menyusup ke kacang-kacangan tertentu dan mendorong terbentuknya suatu reaksi yang terkordinasi dalam tumbuhan tompangan. Reaksi itu diantaranya untuk mengatur pembelahan sel dan sintesa seperangkat protein.

Biasanya tempat infeksi berada di ujung bulu akar yang sedang tumbuh, yang melengkung, bercabang atau berpilin seperti sekrup sebagai reaksi terhadap bakteri yang menyusup. Bakteri itu masuk melalui benang infeksi, kehadiran benang infeksi, mungkin bergabung dengan sinyal dari Rhizobium terhadap permukaan akar, mendorong terjadinya pembelahan sel dalam akar, sehingga terbentuk bintul awal, ketika nodul tumbuh, benang infeksi pertama terus tumbuh dan bercabang, masuk menyelusup diantara sel-sel akar tumbuhan inang.

Sel-sel Rhizobium yang memfiksasi nitrogen dan yang keluar dari bintul disebut bakteroid. Dalam bentuk ini bakteri itu biasanya menjalankan gen nif untuk berekspresi, lalu mengeluarkan amonia yang terbentuk ke dalam jaringan tumbuhan inang. Tumbuhan inang kemudian menggunakan amonia itu dengan membuatnya berkondensasi dengan asam glutamat, untuk membentuk glutamin. Kemudian glutamin ini dipakai untuk menebarkan nitrogen yang telah terfik pada bagian lain tubuh tumbuhan inang itu.

Spesies Rhizobium lain lebih banyak memiliki perbedaan yang bersifat biokimia, di luar perbedaan dalam bentuk jenis tompangan. Spesies kacang-kacangan tertentu hanya diinfeksi oleh spesies bakteri tertentu pula. Bagi beberapa bakteri seperti R. leguminosarum, R. trifolii, dan R. phaseoli, yang membuat bintul masing-masing pada ercis, clover, dan buncis Phaseolus, ternyata hanya jenis tompangan itu yang menjadi ciri untuk membedakan berbagai spesies itu.

Banyak gen yang tak berekspresi pada sel bakteri bebas tapi berekspresi pada bakteroid atau sebaliknya. Susunan biokimia protein yang dibuat dalam bintul juga memperlihatkan perubahan besar dibandingkan pada akar yang tak diinfeksi, paling kurang ada 50 protein baru, disebut nodulin ditemikan khusus terdapat dalam bintul. Secara keseluruhan jumlah macam protein yang khusus terdapat dalam bintul yang berlipat ganda lebih banyak dari itu, beberapa diantaranya seperti enzim glutamin sintetase dan urikase diperlukan untuk asimilasi amonia. Nodulin yang paling banyak ialah leghaemoglobin.

Leghaemoglobin menyebabkan bintul warna merah muda, mekipun banyak orang yang menduga leghaemoglobin berperan untuk melindungi nitrogenase dari kerusakan oleh oksigen, namun ternyata fungsi utamanya adalah untuk menyampaikan oksigen ke bakteroid.

Gen leghaemoglobin kedelai ternyata sama dengan gen haemoglobin mamal, bintul akar yang terbentuk pada tumbuhan bukan kacang-kacangan oleh bakteri Frankia juga mengandung leghaemoglobin.

D.      Analisis Genus Bakteri Rhizobium

Bakteri Rhizobium jauh lebih sederhana dan lebih mudah ditangani untuk dianalisa secara genetis daripada kacang-kacangan inang mereka. Tak mengherankan, bila kemajuan dalam mengidentifikasi gen bakteri yang diperlukan untuk kerja simbiosa dan memfiksasi nitrogen dan pembentukan bintul, jauh lebih cepat daripada kemajuan dalam mengidentifikasi gen tumbuhan yang berperan dalam aktifitas ini. Lagipula isolasi gen nif  dari berbagai bakteri sama besar, sehingga gen K. pneumoniae dapat dipakai sebagai probe untuk memancing gen nif spesies lain.

Plasmid besar yang sama yang membawa gen nif pada spesies Rhizobium tumbuh cepat, juga mengandung seuntaian gen nod yang berperan dalam pembentukan bintul. Beberapa pengamat telah memperlihatkan bahwa pemindahan DNA R. leguminosarum  yang mengandung gen nod yang membuat bintul pada ercis, pada bakteri rhizobium lain yang asalnya membuat bintul pada clover atau buncis, membuat bakteri resipien itu mampu membentuk bintul normal pada ercis. Namun ini bukan berarti bahwa untaian nod plasmid sajalah yang diperlakukan untuk mendorong bakteri Rhizobium membuat bintul. Bakteri dari genus Agrobacterium sebenarnya sekerabat dekat dengan bakteri rhizobium, namun spesies Agrobacterium tidak mampu membuat bintul ataupun memfiksasi nitrogen.

E.       Pengaturan Ekspresi Gen Nod

Gen terakhir dari untaian gen nod yaitu nod telah diperlihatkan berperan sebagai pengatur, mengontrol transkripsi sendiri dan gen-gen nod lain dalam untaian. Jika bakteri rhizobium ditumbuhkan dalam media kultur yang minimal, gen nod  berekspresi kuat, sedang gen-gen nod lain tidak bertranskripsi. Namun ditemukan perbedaan besar jika sel bakteri itu dipaparkan pada zat getahan yang keluar dari akar ercis, clover atau alfalfa. Transkripsi semua gen nod, kecuali nodD lalu meningkat sekitar tujuh puluh kali lipat.